本文標(biāo)題："微生物樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析顯微鏡"
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微生物樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析顯微鏡
當(dāng)降解的DNA成為模板時(shí)，由于模板重建形成的競(jìng)爭(zhēng)，完整模板較低的起始
反應(yīng)濃度，抑制效應(yīng)都將導(dǎo)致檢測(cè)不到PCR產(chǎn)物的存在。較強(qiáng)的或部分的抑
制效應(yīng)可以按上面討論過(guò)的PCR產(chǎn)物二次純化加以消除或者用一系列稀釋的
提取液作為模板。由于模板的片段性導(dǎo)致的低效率PCR擴(kuò)增或缺乏產(chǎn)物可以
通過(guò)初步的無(wú)引物的聚合反應(yīng)重建及隨后的特異PCR加以克服。另外，可以
設(shè)計(jì)的一組PCR反應(yīng)，起始PCR反應(yīng)后所產(chǎn)生的產(chǎn)物作為第二次反應(yīng)的模板
，而所用的引物是第一次反應(yīng)引物內(nèi)側(cè)的引物。
實(shí)際的擴(kuò)增反應(yīng)必須采用標(biāo)準(zhǔn)的程序，用上述兩步嵌合反應(yīng)的方法，2
5山的反應(yīng)體系中，包含72．5pmoles的正向和反向引物，0．2mmolesdNTP
，1．25UTaq酶，2．5P，產(chǎn)品供應(yīng)商提供的?0 X反應(yīng)緩沖液和2P，的DNA提
取液，MgCI：的濃度必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)決定(盡管3mM是標(biāo)準(zhǔn)的起始反應(yīng)濃度)。
復(fù)性溫度，變性、復(fù)性和延伸時(shí)間取決于熱循環(huán)儀的機(jī)型、目標(biāo)片段的長(zhǎng)
度及引物的不同。盡管理論上說(shuō)某些具有3+—5’的外切酶活性的DNA聚合
酶利于長(zhǎng)片段的擴(kuò)增和重建，但我們不能證明使用那些酶比標(biāo)準(zhǔn)Taq酶有什
么優(yōu)越性(Nixon&Golenberg，未發(fā)表)。
一次性空氣過(guò)濾的槍頭經(jīng)常用于防止交叉污染。類似的，所有的試劑
都應(yīng)該分裝成小量，這樣可以檢查和易于校正任何被污染了的溶液。除了
酶和模板DNA外的所有試劑應(yīng)混勻，放在冰上，暴露在短波紫外光下使溶液
中任何雙鏈DNA形成嘧啶二聚體。這將阻止?jié)撛谖廴綝NA的擴(kuò)增。為了避免
接觸不必要的污染，首輪PCR反應(yīng)液可以不作電泳檢測(cè)在第二輪或者嵌合PC
R反應(yīng)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。在嵌合PCR過(guò)程中，第二輪反應(yīng)的引物
應(yīng)合成至第一輪反應(yīng)所用正向引物和反向引物的3+端，加上1 P，的初次反
應(yīng)產(chǎn)物作模板，并使用50P，的反應(yīng)體積，以保證足夠的PCR產(chǎn)物用于最后
測(cè)序，反應(yīng)溫度和時(shí)間必須按照新的引物和反應(yīng)體積加以調(diào)整。第二次擴(kuò)
增以后，用5 P，的反應(yīng)產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠和溴化乙錠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的
存在及其片段大小。
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