目的

生物學(xué)的研究過程通常需經(jīng)三個(gè)階段：首先由基礎(chǔ)的細(xì)胞層次開始，接著進(jìn)入動(dòng)物模式，最后再進(jìn)行ren試驗(yàn)研究；

所以細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)研究最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。本實(shí)驗(yàn)是使用F12 培養(yǎng)液來培養(yǎng)人類橫紋肌肉瘤RD 細(xì)胞株，

借著實(shí)驗(yàn)的操作過程可使操作者熟悉無菌操作與細(xì)胞繼代培養(yǎng)的相關(guān)技術(shù)。

 

 

原理

本章節(jié)所介紹之細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)有三：

細(xì)胞繼代培養(yǎng)技術(shù)：由于細(xì)胞貼附在培養(yǎng)皿上需要鈣離子的參與，所以可利用具有螯合鈣離子特性的EDTA ，配合胰蛋白酶(trypsin) 的作用，將細(xì)胞自培養(yǎng)皿上分離出來。

細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞存活率計(jì)數(shù)技術(shù)：死細(xì)胞由于細(xì)胞膜破損，所以細(xì)胞染劑如：錐藍(lán)(trypan blue) 可自由進(jìn)出細(xì)胞膜，因而將死細(xì)胞的細(xì)胞核染上顏色，但活細(xì)胞則否，所以可配合血球細(xì)胞計(jì)數(shù)盤(hemocytometer) ，于相位差顯微鏡下計(jì)算出活細(xì)胞數(shù)量并估算出細(xì)胞存活率。

 

細(xì)胞保存及解凍技術(shù)：利用抗凍劑DMSO 可以減少細(xì)胞于冷凍過程中受到冰晶的傷害，因此在細(xì)胞溶液中加入適當(dāng)比例的DMSO ，則可于液態(tài)氮中長期保存細(xì)胞株

 

 

材料與器具

實(shí)驗(yàn)儀器及用具

實(shí)驗(yàn)材料

 

實(shí)驗(yàn)儀器及用具

低溫保存管(cryotube) （細(xì)胞用）及低溫保存盒

細(xì)胞培養(yǎng)皿(petri dish)

微量吸管及電動(dòng)吸管(pipette and pipette aid)

血球細(xì)胞計(jì)數(shù)盤(hemocytometer)

相位差顯微鏡

37℃ 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(CO2 incubator)

恒溫水浴槽(water bath)

無菌操作臺(tái)(laminal flow)

桌上型離心機(jī)

液態(tài)氮桶

 

實(shí)驗(yàn)材料

F12 培養(yǎng)液

二次蒸餾水(ddH2O)

胎牛血清(fetal calf serum ；FBS)

重碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)

TE(trypsin-EDTA) 溶液

磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffer-saline ；PBS)

抗生素（penicillin 100,000 IU/L 及streptomycin 100 mg/L ）

細(xì)胞染劑(trypan blue solution 0.4%, w/v)

 

抗凍劑(dimethyl sulfoxide ；DMSO)

75% 酒精