本文標(biāo)題："大腸桿菌中表達和純化蛋白質(zhì)載體的特征技術(shù)"
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大腸桿菌中表達和純化蛋白質(zhì)載體的特征技術(shù)
在原核生物特別是大腸桿菌中表達真核生物的目的基因。純化出的
蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能，蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)、蛋白
質(zhì)一核酸間的相互作用，制備抗體及突變研究等的基礎(chǔ)，也是基因
克隆的目的所在。在大腸桿菌中表達和純化蛋白質(zhì)操作相對簡便，
表達效率很高，而且表達量容易控制，因此應(yīng)用最為廣泛。目前蛋
白質(zhì)表達的方法大多是將編碼所需產(chǎn)物的基因插入表達型質(zhì)粒，然
后將該載體導(dǎo)人細胞。典型的表達載體除具有一般克隆載體的特征
外還包含指導(dǎo)相應(yīng)mRNA大量合成的啟動子、允許其在宿主體內(nèi)自主
復(fù)制的序列和能增強mRNA翻譯效率的序列。
1)原核表達載體特點
根據(jù)不同需要，人們構(gòu)建了多種原核表達載體，即在相應(yīng)的受
體細胞中能表達外源基因的載體，這些原核表達載體通常有如下特
點：①有一個強的原核啟動子及其兩側(cè)的調(diào)控序列；②應(yīng)有SD序列
，而SD序列與起始密碼子AUG之間要有合適的距離；③在克隆基因
與啟動子之間應(yīng)有正確的可讀框；④外源基因下游應(yīng)加入不依賴p
因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。
2)提高外源基因表達水平的措施
只要考慮到表達載體、外源基因的性質(zhì)、原核細胞的啟動子、
可讀框及宿主調(diào)控系統(tǒng)等條件，一般都可使外源基因在原核細胞中
有所表達。但如何使外源基因在原核細胞中獲得高效表達仍是需要
努力探索的目標(biāo)之一。現(xiàn)在可通過以下方法提高基因的表達水平：
①調(diào)整SD序列與AUG之間的距離；②用點突變的方法改變某些堿基
，以消除mRNA二級結(jié)構(gòu)，提高翻譯的完整性；③在真核基因下游插
入重復(fù)性回文序列或其他具有反向重復(fù)序列的DNA片段，防止限制
性外切核酸酶的攻擊，從而起到穩(wěn)定mR—NA，提高表達水平的作用
；④通過誘導(dǎo)表達或誘導(dǎo)復(fù)制，減輕細胞代謝負荷，提高外源基因
表達效率；⑤在外源蛋白N端加一段原核短肽或采用某種蛋白酶突
變菌株，保護表達蛋白不被降解。
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